使用說(shuō)明：

1. 裝載ROS 探針

1.1 原位裝載探針(僅適?于貼壁細(xì)胞)

a) 細(xì)胞準(zhǔn)備：檢測(cè)前?天進(jìn)?細(xì)胞鋪板，確保檢測(cè)時(shí)細(xì)胞數(shù)量?于5×105 /ml。

b) 藥 物誘導(dǎo)：去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加???清培養(yǎng)基稀釋的藥 物處理，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，實(shí)際誘導(dǎo)時(shí)間由藥 物特性和細(xì)胞類型決定。

c) （可選）陽(yáng)性對(duì)照：先???清培養(yǎng)基等稀釋陽(yáng)性對(duì)照（Rosup, 100 mM）到常??作濃度100 μM，加?細(xì)胞，37℃避光孵育0.5～4 h，以提?活性氧?平，不同細(xì)胞類型存在差異。例如：HeLa 細(xì)胞需孵育30-60 min，MRC5 ?胚胎成纖維細(xì)胞則需孵育90 min。

d) ROS 探針準(zhǔn)備：探針裝載前按照1:1000 ???清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

e) ROS 探針裝載：吸除處理藥 物，加?適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA ?作液。加?的體積需充分蓋住細(xì)胞。例如：6孔板通常不少于1000 μL，對(duì)于96 孔板通常不少于100 μL。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min。

f) 細(xì)胞清洗：???清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1～2 次，以充分去除未進(jìn)?細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

1.2 收集細(xì)胞后裝載探針(適?于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞)

a) 細(xì)胞準(zhǔn)備：按照標(biāo)準(zhǔn)?法培養(yǎng)細(xì)胞，必須保證檢測(cè)?細(xì)胞狀態(tài)。按照適當(dāng)?法，清洗并收集?量的細(xì)胞。

b) 藥 物誘導(dǎo)：將收集好的細(xì)胞懸浮于適量稀釋好的藥 物，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，實(shí)際誘導(dǎo)時(shí)間由藥 物特性和細(xì)胞類型決定。

c) （可選）陽(yáng)性對(duì)照：先???清培養(yǎng)基稀釋陽(yáng)性對(duì)照（Rosup, 100 mM）到常??作濃度100 μM，加?細(xì)胞，37℃避光孵育0.5～4 h 以提?活性氧?平，不同細(xì)胞類型存在差異。例如：HeLa 細(xì)胞需孵育30-60 min，MRC5 ?胚胎成纖維細(xì)胞則需孵育90min。

d) ROS 探針準(zhǔn)備：探針裝載前，按照1:1000 ???清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

e) 探針裝載：除去細(xì)胞內(nèi)藥 物，離?收集細(xì)胞，加?稀釋好的探針，使其細(xì)胞密度為1×106 ～ 2×107 。

注意：細(xì)胞密度需根據(jù)后續(xù)的檢測(cè)體系，檢測(cè)?法，以及檢測(cè)總量來(lái)進(jìn)?調(diào)整。例如：對(duì)于流式分析，單管檢測(cè)內(nèi)細(xì)胞數(shù)?不少于104 ，也不可多于106 。

f) 細(xì)胞清洗：???清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1-2 次，以充分去除未進(jìn)?細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

2. 熒光顯微照相操作方法

a) 對(duì)貼壁??細(xì)胞或活組織，可直接在熒光顯微鏡下觀察；對(duì)懸浮??細(xì)胞，取25-50 μL 細(xì)胞懸液滴到?張顯微載玻?上，再蓋上?張蓋玻?。

b) 熒光顯微鏡下，選?FITC 濾光?觀察熒光，去除背景觀察熒光的變化。

3. 流式細(xì)胞分析操作方法

a) 對(duì)貼壁??細(xì)胞，?胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液；對(duì)懸浮??細(xì)胞，直接收集細(xì)胞。?0.5-1 mL PBS 重懸細(xì)胞(0.5～1x 105 /ml)。

b) 選擇流式細(xì)胞儀FL1 或BL1 通道，488nm 激發(fā)，測(cè)定530nm 的發(fā)射，細(xì)胞應(yīng)可分成兩個(gè)亞群：ROS 陰性細(xì)胞僅有很低的熒光強(qiáng)度，ROS 陽(yáng)性細(xì)胞有較強(qiáng)的綠?熒光。

4.參數(shù)設(shè)置

使?488nm激發(fā)波?，525nm發(fā)射波?，實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DCF的熒光光譜和FITC?常相似，可以?FITC的參數(shù)設(shè)置檢測(cè)DCF。DCF的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖。