一、細(xì)胞復(fù)蘇和接種
1. 37℃預(yù)熱大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液（RM-001）和基礎(chǔ)培養(yǎng)液（RM-001B）。
2. 從液氮中取出細(xì)胞產(chǎn)品管，快速將其置入37℃水浴中解凍，直到管中只剩下最后一片結(jié)晶（注意：不要讓水沒過產(chǎn)品管）。
3. 在生物安全柜中，用75%的酒精擦拭產(chǎn)品管外壁。
4. 將產(chǎn)品管中的細(xì)胞移至15 ml無菌離心管中，慢慢逐滴加入預(yù)溫的37℃ 基礎(chǔ)培養(yǎng)液（RM-001B）4-5ml混勻，邊滴加邊搖勻。
5. 用1ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液（RM-001B）沖洗產(chǎn)品管，并將其轉(zhuǎn)移到15 ml離心管中，邊滴加邊搖勻。
6. 輕輕混勻細(xì)胞后，取10 μl細(xì)胞懸液和10 μl臺(tái)盼藍(lán)混勻，從中取10 μl計(jì)數(shù)。 這一步驟非常重要，能確定您收到的產(chǎn)品是否合格（詳見如何計(jì)數(shù)復(fù)蘇的細(xì)胞）
7. 細(xì)胞懸液在1 000 rpm，室溫條件下，離心5分鐘，去除上清。
8. 加完全培養(yǎng)液4-5ml, 調(diào)整細(xì)胞量，輕輕混勻細(xì)胞，備用。
9. 按5 000-7 500細(xì)胞/cm2接種細(xì)胞。
10. 每個(gè)T25培養(yǎng)瓶中加完全培養(yǎng)液（RM-001）3-5ml， 后置于37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
二、細(xì)胞換液和培養(yǎng)
注意：復(fù)蘇或傳代后的細(xì)胞，請(qǐng)于24小時(shí)后，第一次更換培養(yǎng)液
1. 復(fù)蘇后的細(xì)胞經(jīng)37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，此時(shí)細(xì)胞已完全貼壁，更換培養(yǎng)液后，請(qǐng)繼續(xù)在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
2. 之后，每2-3天更換培養(yǎng)液1次，至細(xì)胞長至覆蓋培養(yǎng)面的 80% 可進(jìn)行傳代或凍存。
3. 換液前，請(qǐng)將培養(yǎng)液從4℃中取出，使其恢復(fù)到室溫。
三、消化細(xì)胞
1. 消化液的配制：pH7.0-7.2 ，分別配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液，用前按1：1混合。將PBS或D-Hank'S液, 消化液，含10% FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)液回復(fù)到室溫。
2. 具體操作如下：
（1） 吸去培養(yǎng)液，加入3 ml PBS或D-Hank'S液，使PBS或D-Hank'S液均勻的分布在培養(yǎng)瓶細(xì)胞表面。1分鐘之后，吸去PBS或D-Hank'S液。
（2） 每個(gè)T25培養(yǎng)瓶加入消化液 2 ml，使消化液均勻的分布在培養(yǎng)瓶細(xì)胞面。
（3） 25℃消化2分鐘，在顯微鏡下看細(xì)胞回縮成圓形后，輕輕震動(dòng)使絕大部細(xì)胞脫落。
（4） 向每個(gè)培養(yǎng)瓶中加 3-5 ml 含10% FBS的 基礎(chǔ)培養(yǎng)液(RA-001B) 中和胰酶的消化作用。
（5） 用吸管輕輕吹打培養(yǎng)面使細(xì)胞完全脫落后，吸至15 ml無菌離心管內(nèi)。
（6） 20℃，1 500 rpm 離心 5分鐘，棄上清。
（7） 加入一定完全培養(yǎng)液（RM-001)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量后，抽樣加入胎盤藍(lán)計(jì)數(shù)，得到細(xì)胞數(shù)和活性后，按細(xì)胞數(shù)傳代或凍存。
四、細(xì)胞傳代
1. 消化細(xì)胞（詳見第三步）。
2. 按5000-7500個(gè)細(xì)胞/cm2接種細(xì)胞于T25的培養(yǎng)瓶中。
3. 每個(gè)培養(yǎng)瓶中加完全培養(yǎng)液（RM-001）3-5ml，后置于37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
五、細(xì)胞凍存
1. 調(diào)整細(xì)胞數(shù)5×105 /ml，加入一定量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液（RM-001B)。之后，配制等量的冷凍保護(hù)劑。
2. 冷凍保護(hù)劑的配制：FBS占80％，DMSO占20％
3. 將細(xì)胞懸液于冰浴中，慢慢逐滴加入冷凍保護(hù)劑，邊滴加邊搖動(dòng)，加完后用輕輕吹打混勻。
4. 在冰浴中，將細(xì)胞分裝于凍存管中，每管1ml或1.8 ml。
5. 將凍存管置于凍存盒(NALGENE Cat No. 5100-0001)內(nèi)，放入-80℃冰箱中，24小時(shí)后轉(zhuǎn)入液氮中保存。
